包裝與品牌:
產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 品牌
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TRAzol | 20 ml/100 ml | 一研 |
產(chǎn)品介紹:
實(shí)驗(yàn)操作
1. TRAzol的使用量情況如下。
樣品量
10 cm2的貼壁培養(yǎng)細(xì)胞
107的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞
100 μl的白細(xì)胞
50~100 mg的普通組織樣品
50~100 mg的特殊組織樣品(肝、脾、骨及軟骨等)
15~30 mg的植物材料(多糖和多酚含量不高的)
2. 實(shí)驗(yàn)樣品的研磨和勻漿。
A. 貼壁培養(yǎng)細(xì)胞
① 倒出培養(yǎng)液,用1×PBS清洗一次。
② 每10 cm2生長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞中加入1 ml的TRAzol,水平放置片刻,使裂解液均勻分布于細(xì)胞表面并裂解細(xì)胞,然后使用移液槍吹打細(xì)胞使其脫落(對(duì)于貼壁牢固的培養(yǎng)細(xì)胞可用細(xì)胞刮勺剝離細(xì)胞)。
③ 將內(nèi)含細(xì)胞的裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中,用移液槍反復(fù)吹吸直至裂解液中無(wú)明顯沉淀。
④ 室溫靜置5分鐘。
B. 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞
① 將懸浮培養(yǎng)細(xì)胞連同培養(yǎng)液一起倒入離心管中,8,000 g 4℃離心2分鐘,棄上清。
② 向每107個(gè)細(xì)胞中加入l~2 ml的TRIzol。
③ 用移液槍反復(fù)吹吸直至裂解液中無(wú)明顯沉淀。
④ 室溫靜置5分鐘。
C. 動(dòng)物組織、植物材料樣品
① 將超低溫凍結(jié)的RNA提取樣品稱量后迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中,用研杵研磨組織,其間不斷加入液氮,直至研磨成粉末狀(無(wú)明顯的可見顆粒,如果沒有研磨徹底會(huì)影響RNA的收率和質(zhì)量)。
② 對(duì)于普通的RNA提取樣品,可以向研缽中加入適量的TRAzol,將研磨成粉末狀的樣品完全覆蓋,然后室溫靜置,直至樣品完全融化,再用研杵繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀。
對(duì)于特殊樣品,如肝、脾、骨及軟骨等,可以將研磨成粉末狀的樣品加入到含有適量的TRAzol的勻漿管中,把勻漿管置于冰浴中進(jìn)行勻漿,直至勻漿液呈無(wú)顆粒透明狀。
③ 將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中,室溫靜置5分鐘。
④ 12,000 g 4℃離心5分鐘。
⑤ 小心吸取上清液,移入新的離心管中(切勿吸取沉淀)。
3. Total RNA的提取。
① 向上述步驟2的勻漿裂解液中加入氯仿(TRAzol的1/5體積量),蓋緊離心管蓋,用力振蕩(氯仿沸點(diǎn)低、易揮發(fā),振蕩時(shí)應(yīng)小心離心管蓋突然彈開)。待充分乳化溶液呈乳白狀(無(wú)分相現(xiàn)象)后,再室溫靜置5分鐘。
② 12,000 g 4℃離心15分鐘。
③ 從離心機(jī)中小心取出離心管,此時(shí)勻漿液分為三層,即:無(wú)色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機(jī)相。吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中(切忌吸出白色中間層)。
④ 向上清中加入等體積的異丙醇,上下顛倒離心管充分混勻后,在15~30℃下靜置10分鐘。
⑤ 12,000 g 4℃離心10分鐘。一般在離心后,試管底部會(huì)出現(xiàn)沉淀。
4. RNA沉淀的清洗。
小心棄去上清,緩慢地沿離心管壁加入75%的乙醇l ml(切勿觸及沉淀),輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁,12,000 g 4℃離心5分鐘后小心棄去乙醇(為了更好地控制RNA中的鹽離子含量,應(yīng)盡量除凈乙醇)。
5. RNA的溶解。
室溫干燥沉淀2~5分鐘(不可以離心或加熱干燥,否則RNA將會(huì)很難溶解,有關(guān)RNA溶解可以參考Troubleshooting中的相關(guān)說(shuō)明),加入適量的RNase-free水溶解沉淀,必要時(shí)可用移液槍輕輕吹打沉淀,待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。
注意事項(xiàng):
● RNA樣本保存液如出現(xiàn)沉淀,37℃加熱振蕩混勻。
● 加入RNA樣本保存液后,樣本不能立即置于-20℃或-80℃,要先4℃置放過(guò)夜,待組織充分浸潤(rùn)后再置于低溫保存。
● 樣品浸沒在RNA樣本保存液中,可在37℃保存1天,25℃保存1周,4℃保存1個(gè)月,-20℃長(zhǎng)期保存;使用時(shí)請(qǐng)注意保存時(shí)限。
● 保存在RNA樣本保存液中的樣本可不經(jīng)特殊處理,離心或直接使用和新鮮組織一樣的RNA提取方法提取RNA。
● RNA樣本保存液可以配合各種常見的RNA提取試劑盒使用,如東盛、invitrogen、omega等公司出品的RNA提取試劑盒,不影響試劑盒操作,不影響提取所得RNA質(zhì)量及其后續(xù)實(shí)驗(yàn)。