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驢抗羊IgG免疫血清抗體材料和方法步驟

發(fā)表時間:2021-01-26 16:21

驢抗羊IgG免疫血清抗體材料和方法


  1.1 材料 人成骨肉瘤MG63細(xì)胞為本實驗室保存。重組質(zhì)粒MycSSH1L(WT)、MycSSH1L(S937A S978A/2SA)以及recombinant cofilinHis6由王巖教授惠贈。脂質(zhì)體 2000。高糖DMEM培養(yǎng)基,胎牛血清,胰蛋白酶和EDTA(Sigma 公司)。A23187,KN93,CaM,重組Ca2+/CaMK Ⅱ(Rat Brain,Calbiochem)??贵w:Myc (9E10;Roche),HA (3F10;Roche),Pcofilin,Cofilin(Santa Cruz), CaMKⅡδ1δ4 (Trans Genic Inc.),PCaMKⅡα/β(Thr286/287;Upstate)。免疫共沉淀(Protein Gagarose)試劑盒。

抗體.jpg

  1.2 蛋白印跡實驗 MG63細(xì)胞鋪于35 mmol/L培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞密度達(dá)到60%~70%時,轉(zhuǎn)染MycSSH1L,48 h后換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h,分別加入濃度為0.5,1,2.5,5 μmol/L的A23187孵育10 min后裂解細(xì)胞,離心取上清加入凝膠加樣緩沖液,沸水浴上加熱5 min,上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交〔一抗分別為Pcofilin、Cofilin、PCaMK Ⅱ δ及CaMK Ⅱ δ(14)〕、ECL顯色。


  1.3 體外激酶測定 MycSSH1L(WT)及其突變體MycSSH1L(2 SA)分別轉(zhuǎn)染至MG63細(xì)胞,48 h后采用免疫共沉淀(Protein Gagarose)試劑盒的方法及抗cmyc抗體,對照組為抗IgG抗體。回收MycSSH1L,加入0.6 μg/ml重組活性CaMKⅡ(單獨或同時加入抑制劑KN93)以及100 μmol/L ATP、5 μCi〔γ32P〕ATP 于 20 μl 激酶反應(yīng)緩沖液中,30℃反應(yīng)40 min。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行SDSPAGE電泳、轉(zhuǎn)膜,應(yīng)用放射自顯影技術(shù)檢測32P 標(biāo)記的SSH1L水平。

  1.4 體外SSH1L磷酸酶活性測定實驗 MycSSH1L(WT)或MycSSH1L (2 SA)轉(zhuǎn)染至MG63細(xì)胞,48 h后,采用免疫共沉淀(Protein Gagarose)試劑盒的方法及抗cmyc抗體,對照組為抗IgG抗體?;厥誐ycSSH1L,加入0.6 μg/ml CaMKⅡ(單獨或同時加入抑制劑KN93),20 μg/ml CaM,以及 6.3 μg/ml cofilinHis6 于 20 μl 反應(yīng)緩沖液(50 mol/L HEPES,pH 7.4,0.1 mol/L CaCl2,0.5 mol/L EDTA,3 mol/L MgCl2,100 mmol/L NaCl,1 mol/L dithiothreitol,0.5 mg/ml BSA,1 μg/ml leupeptin),中30℃反應(yīng)2 h。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行SDSPAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交(一抗分別為Pcofilin,Cofilin, cmyc 抗體)、ECL顯色。


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